Projekt finansowany przez Narodowe Centrum Nauki w ramach konkursu SONATA 18 (nr 2022/47/D/NZ7/01821).
Celem projektu było opracowanie i charakterystyka wielofunkcyjnych biomateriałów polisacharydowych o potencjalnym zastosowaniu jako materiały opatrunkowe, w szczególności do zabezpieczania ran narażonych na zakażenia w medycynie ratunkowej i warunkach pola walki (TCCC).
Głównym założeniem była koncepcja materiałów „trzy w jednym”, łączących matrycę biopolimerową, hybrydowe nanokwiatki białkowo-nieorganiczne oraz składnik bioaktywny pochodzenia roślinnego. Równolegle rozwijano strategie chemicznej stabilizacji polisacharydów, umożliwiające kontrolowanie struktury, trwałości i właściwości funkcjonalnych otrzymywanych biomateriałów.
W ramach projektu opracowano i scharakteryzowano szeroką grupę biomateriałów polisacharydowych w postaci porowatych gąbek oraz folii polimerowych. Do ich otrzymywania wykorzystano polisacharydy o zróżnicowanej budowie chemicznej, takie jak chitozan, lewan, kefiran, paramylon, laminaryna, lentinan i fukoidan.
Materiały funkcjonalizowano składnikami bioaktywnymi, m.in. olejem konopnym, olejkiem jałowcowym, ekstraktami z konopi przemysłowych odmiany Henola oraz ekstraktami z gojnika górskiego (Sideritis scardica). W wybranych układach zastosowano również wiolaceinę i pochodną zasady Mannicha. Badania pozwoliły określić, w jaki sposób dobór matrycy polisacharydowej i składników funkcjonalnych wpływa na mikroarchitekturę, właściwości fizykochemiczne i aktywność biologiczną otrzymanych materiałów.
Jednym z kluczowych osiągnięć projektu było opracowanie alternatywnej strategii chemicznej stabilizacji biomateriałów polisacharydowych z wykorzystaniem makrocząsteczkowych czynników sieciujących. W tym celu otrzymano dialdehydowe pochodne pięciu polisacharydów: chitozanu, kefiranu, lewanu, laminaryny i lentinanu.
Zastosowanie tych pochodnych umożliwiło tworzenie sieci polimerowych poprzez reakcje grup aldehydowych z grupami aminowymi chitozanu, prowadzące do powstawania wiązań iminowych. Rozwiązanie to stanowiło alternatywę dla konwencjonalnych małocząsteczkowych czynników sieciujących.
Przeprowadzone badania wykazały, że skuteczność sieciowania oraz właściwości końcowych biomateriałów zależą nie tylko od zawartości grup aldehydowych, lecz również od budowy chemicznej zastosowanych polisacharydów. Odpowiedni dobór makrocząsteczkowego czynnika sieciującego pozwalał regulować strukturę, właściwości mechaniczne, zdolność do pęcznienia oraz stabilność otrzymanych materiałów.
Istotnym osiągnięciem projektu było opracowanie wieloskładnikowych biomateriałów polisacharydowych zawierających hybrydowe nanokwiatki białkowo-nieorganiczne. W badaniach wykorzystano nanokwiatki otrzymane na bazie dwóch białek: bromelainy oraz zeiny, które zintegrowano z odpowiednio zaprojektowanymi matrycami polimerowymi.
Pierwotną koncepcję materiałów „trzy w jednym” zrealizowano w układach zawierających matrycę złożoną z chitozanu, lewanu, fukoidanu i lentinanu, funkcjonalizowaną nanokwiatkami zeiny oraz ekstraktami z gojnika górskiego (Sideritis scardica). Materiały stabilizowano z wykorzystaniem lentinanu dialdehydowego, uzyskując wieloskładnikowe struktury o regulowanych właściwościach fizykochemicznych i biologicznych.
Równolegle opracowano kompozyty chitozanowo-laminarynowe zawierające nanokwiatki bromelainy oraz pochodną zasady Mannicha o wcześniej wykazanej aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Wprowadzenie tych składników umożliwiło otrzymanie materiałów łączących odpowiednie właściwości strukturalne, mechaniczne i sorpcyjne z aktywnością biologiczną.
Przeprowadzone badania wykazały, że dobór składu matrycy, sposobu jej sieciowania oraz rodzaju składników funkcjonalnych pozwala kształtować mikroarchitekturę i właściwości otrzymanych biomateriałów. Uzyskane wyniki stanowią podstawę do dalszego projektowania wielofunkcyjnych materiałów opatrunkowych.
Opracowane biomateriały poddano kompleksowej ocenie właściwości biologicznych, obejmującej aktywność przeciwdrobnoustrojową, antyoksydacyjną i potencjał przeciwzapalny, a także cytokompatybilność, hemolizę oraz wpływ na migrację fibroblastów w warunkach in vitro.
Wykazano aktywność wybranych biomateriałów wobec drobnoustrojów związanych z zakażeniami ran, w tym Staphylococcus aureus (również MRSA), Pseudomonas aeruginosa oraz Candida albicans. Szczególnie korzystne wyniki uzyskano dla kompozytów chitozanowo-laminarynowych zawierających nanokwiatki bromelainy i pochodną zasady Mannicha, dla których w przeprowadzonych badaniach odnotowano redukcję żywotności MRSA o 97%, P. aeruginosa o 93% oraz C. albicans o 88%.
Aktywność przeciwdrobnoustrojową wybranych kompozytów porównano również z komercyjnym opatrunkiem Bactigras. W części przeprowadzonych testów nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy badanymi materiałami a kontrolą dodatnią, co wskazuje na ich potencjał w dalszych badaniach nad aktywnymi materiałami opatrunkowymi.
Wybrane biomateriały wykazywały również aktywność antyoksydacyjną oraz zdolność hamowania denaturacji białka w zastosowanym modelu laboratoryjnym. W przypadku kompozytów zawierających nanokwiatki bromelainy i pochodną zasady Mannicha aktywność antyoksydacyjna oznaczona metodą DPPH osiągała 87,4%, natomiast hamowanie denaturacji białka wynosiło do 83,6%.
Badania z wykorzystaniem fibroblastów wykazały, że odpowiednia funkcjonalizacja matryc polisacharydowych może istotnie wpływać na odpowiedź komórkową. Szczególnie interesujące wyniki uzyskano dla kompozytów chitozanowo-laminarynowych zawierających nanokwiatki bromelainy i pochodną zasady Mannicha. Po 72 godzinach inkubacji żywotność komórek MRC-5 przekraczała 95%, podczas gdy dla niefunkcjonalizowanej matrycy chitozanowo-laminarynowej obserwowano znaczne obniżenie żywotności komórek.
W przypadku wybranych biomateriałów wykazano również niski poziom hemolizy, nieprzekraczający 5% w zastosowanych warunkach eksperymentalnych.
Wpływ opracowanych materiałów na zachowanie komórek oceniono również metodą scratch assay, pozwalającą monitorować zamykanie obszaru bezkomórkowego w hodowli fibroblastów. Badania wykazały, że skład i sposób funkcjonalizacji biomateriałów wpływały na przebieg tego procesu.
W przypadku kompozytów zawierających nanokwiatki bromelainy i pochodną zasady Mannicha uzyskano 90–95% zamknięcia szczeliny po 96 godzinach, w porównaniu z około 60% dla niefunkcjonalizowanej matrycy chitozanowo-laminarynowej. Korzystne wyniki uzyskano również dla wybranych materiałów zawierających nanokwiatki zeiny i ekstrakty z gojnika górskiego, dla których obserwowano całkowite zamknięcie obszaru bezkomórkowego w analizowanym okresie.
Uzyskane rezultaty wskazują na możliwość projektowania biomateriałów łączących aktywność przeciwdrobnoustrojową z korzystnymi wynikami wybranych badań biologicznych, stanowiąc podstawę do dalszej oceny ich potencjalnych zastosowań opatrunkowych.
Istotnym elementem projektu była charakterystyka oddziaływań opracowanych biomateriałów z białkami osocza, w szczególności albuminą i fibrynogenem. Badania wykazały, że skład chemiczny matrycy polisacharydowej, sposób jej funkcjonalizacji oraz właściwości powierzchniowe wpływają na ilość i charakter adsorbowanych białek.
W przypadku wieloskładnikowych biomateriałów zawierających nanokwiatki zeiny i ekstrakty z gojnika górskiego zaobserwowano wzrost adsorpcji obu białek w porównaniu z materiałem odniesienia. Po 24 godzinach adsorpcja albuminy wzrosła z 3,1 do 3,9–4,0 µg/cm², natomiast fibrynogenu z 2,8 do 3,5–3,6 µg/cm². Analiza izoterm adsorpcji wykazała lepsze dopasowanie danych eksperymentalnych do modelu Freundlicha niż Langmuira, wskazując na niejednorodny charakter oddziaływań białek z powierzchnią badanych materiałów.
Uzyskane wyniki potwierdziły możliwość modulowania adsorpcji białek poprzez odpowiedni dobór składników i modyfikację mikroarchitektury biomateriałów, dostarczając informacji istotnych dla projektowania materiałów przeznaczonych do kontaktu ze środowiskiem biologicznym.
W ramach projektu przeprowadzono badania stabilności biomateriałów w warunkach przyspieszonego starzenia klimatycznego (40°C, 75% wilgotności względnej), obejmujące okresy trzech i sześciu miesięcy. Oceniano wpływ warunków przechowywania na strukturę, właściwości fizykochemiczne oraz wybrane właściwości biologiczne otrzymanych materiałów.
W badaniach sześciomiesięcznych wykazano istotne różnice w trwałości materiałów chitozanowych i lewanowych sieciowanych lewanem dialdehydowym. Biomateriały chitozanowe zachowywały integralność strukturalną przez cały okres eksperymentu, podczas gdy materiały lewanowe utrzymywały ją przez około cztery miesiące, a następnie ulegały postępującej degradacji. Obserwacje makroskopowe i mikroskopowe potwierdziły, że rodzaj matrycy polisacharydowej odgrywa kluczową rolę w kształtowaniu trwałości materiałów.
Badania trzymiesięcznego starzenia rozszerzono na zaawansowane biomateriały wieloskładnikowe, zawierające nanokwiatki zeiny i ekstrakty z gojnika górskiego. Oceniono zmiany ich właściwości fizykochemicznych i biologicznych, w tym aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz hemolizy. Wykazano, że wybrane materiały zachowywały korzystne właściwości biologiczne po ekspozycji w komorze klimatycznej, przy poziomie hemolizy poniżej 5%.
Uzyskane wyniki potwierdziły znaczenie składu matrycy, sposobu sieciowania oraz obecności składników funkcjonalnych dla stabilności biomateriałów. Stanowią one podstawę do dalszych badań nad trwałością i warunkami przechowywania potencjalnych materiałów opatrunkowych.
Realizacja projektu przyczyniła się do poszerzenia wiedzy z zakresu chemii polimerów, inżynierii materiałowej oraz biomateriałów funkcjonalnych, w szczególności dotyczącej projektowania aktywnych materiałów polisacharydowych o potencjalnych zastosowaniach opatrunkowych.
Jednym z najważniejszych osiągnięć było wykazanie, że właściwości biomateriałów można kształtować poprzez odpowiedni dobór matrycy polisacharydowej, sposobu jej chemicznej stabilizacji oraz rodzaju składników funkcjonalnych. Opracowanie dialdehydowych pochodnych polisacharydów jako makrocząsteczkowych czynników sieciujących rozszerzyło możliwości kontrolowania struktury, właściwości mechanicznych, sorpcyjnych i trwałości otrzymanych materiałów.
Istotny wkład naukowy stanowiło również opracowanie wieloskładnikowych biomateriałów z hybrydowymi nanokwiatkami białkowo-nieorganicznymi oraz określenie zależności pomiędzy ich składem, mikroarchitekturą i właściwościami biologicznymi. Badania adsorpcji albuminy i fibrynogenu dostarczyły dodatkowych informacji dotyczących oddziaływań na granicy materiał–białko, istotnych dla projektowania biomateriałów przeznaczonych do kontaktu ze środowiskiem biologicznym.
Uzyskane wyniki stanowią podstawę do dalszego rozwoju wielofunkcyjnych materiałów opatrunkowych, łączących odpowiednie właściwości fizykochemiczne z aktywnością przeciwdrobnoustrojową. Dalsze badania, obejmujące bardziej zaawansowane modele biologiczne oraz bezpośrednią ocenę właściwości hemostatycznych, pozwolą zweryfikować potencjał opracowanych rozwiązań w kontekście medycyny ratunkowej i zabezpieczania ran w warunkach pola walki (TCCC).
Wyniki uzyskane podczas realizacji projektu przedstawiono w dziewięciu publikacjach naukowych opublikowanych w międzynarodowych czasopismach.
Osiem spośród tych publikacji weszło w skład cyklu prac stanowiącego osiągnięcie naukowe pt. „Strategie stabilizacji i funkcjonalizacji polisacharydów w projektowaniu aktywnych biomateriałów”, przedstawione w moim postępowaniu habilitacyjnym.
· Wydział Chemii UMK, ul. Gagarina 7, 87-100 Toruń